细胞冻存是将细胞置于低温环境中，以减少其代谢活动，从而实现长时间的保存与保种，供后续实验或临床使用。通常采用慢冻原则来进行细胞冻存，这样可以使细胞逐步脱水，避免因形成大冰晶而损害细胞。

一、原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动和酶活性几乎完全停止；当温度低于-130℃时，细胞存活率达到最佳状态。液氮可以有效实现细胞的长期保存。使用冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO），能够迅速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程，同时提高细胞膜的通透性，增加细胞内的离子浓度，从而减少细胞内冰晶的形成，达到保护细胞的效果。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液。
2. 用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（该步骤与细胞传代操作相同）。
3. 终止消化后，重悬细胞，并转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟。
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，确保细胞冻存的最佳密度在5×10^6~1×10^7/ml之间，一般不低于5×10^5/ml。
5. 分装后，拧紧冻存管盖并做好标记。
6. 将分装好的冻存管放入程序降温盒中，置于-80℃冰箱过夜。
7. 最后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液吹吸均匀，并将其转移到离心管中。
2. 1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀。
3. 使用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10^6/ml，通常不低于5×10^5/ml。
4. 完成分装后，拧紧冻存管盖并做好标记。
5. 将冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱过夜。
6. 最后，将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

1. 进行细胞培养、传代和冻存时，必须严格遵循无菌操作。
2. 传代过程中的消化需适当，时间受到消化液种类和加入量等多种因素影响，应参考培养细胞形态变化，及时终止消化。
3. 建议在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行传代。
4. 冻存液需提前配置，切勿直接将Z6·尊龙凯时 DMSO加入细胞悬液。
5. 选择汇合度为80%-90%且活力达90%以上的细胞进行冻存，以确保细胞状态最佳，冻存密度可基于细胞特性调整。
6. 程序冻存盒、冻存液和完全培养基等试剂应在室温下回温使用。
7. 冻存前需注意控制消化时间、吹打力度、离心转速和时间，以避免细胞损伤。
8. 冻存管盖子必须拧紧，防止水浴复苏时水分渗入造成污染。
9. 细胞不应长期存放在-80℃冰箱中，建议放置时间不超过3天。
10. 如果液氮或冰箱距离细胞房较远，应将细胞置于干冰或冰盒中运输到细胞房。

通过严格遵循这些步骤和注意事项，可以有效提高细胞冻存的成功率，确保细胞在后续实验中的可用性。Z6·尊龙凯时致力于提供高质量的细胞冻存解决方案，帮助科研人员更好地保存和应用细胞资源。