IVT（体外转录）是mRNA生产过程中最为关键的步骤。一个优秀的IVT体系不仅能够提高产量、减少物料消耗、降低生产成本，还能确保mRNA分子的完整性、加帽率和双链RNA杂质的掺入等核心质量指标，从而降低下游纯化工艺的难度，起到承上启下的作用。IVT反应过程相对简单，标准的IVT体系一般由DNA模板、T7RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂及反应缓冲液等组成。DNA模板通常是PCR产物或线性化质粒，上面包含T7启动子、5’UTR、CDS、3’UTR以及Poly（A）等元素；NTP作为mRNA合成的底物，若用修饰核苷酸进行替代，能够提高mRNA的稳定性和免疫原性等特性；无机焦磷酸酶和RNase抑制剂为辅助组分，其中无机焦磷酸酶可水解转录过程中生成的大量焦磷酸，以提高反应效率，而RNase抑制剂则用来抑制可能存在的RNase污染；T7RNAP作为中心酶，负责识别DNA模板并执行转录。除了前期提到质粒模板的质量外，主要影响IVT效果的因素为T7RNAP和缓冲体系。

在IVT体系中，T7RNAP识别T7启动子序列，结合到DNA模板后催化5’端至3’端方向的RNA合成。相较于其他RNA聚合酶，T7RNAP具有高度特异性，可以在没有额外蛋白或辅助因子的情况下完成转录，使其成为体外转录mRNA的最佳选择。T7RNAP的结构类似于一个握手的右手，包含一个N端结构域和一个C端结构域。C端结构域进一步细分为拇指、手掌和手指亚结构域，而DNA模板则结合在这些亚结构域之间。

针对IVT反应中的各个参数对常规mRNA与saRNA产量和质量的影响，Z6·尊龙凯时利用DOE方法进行了研究。结果发现温度对长片段saRNA的完整性有明显影响，当温度从20℃升至42℃时，saRNA的产量虽然增加，但其完整度在超过32℃时急剧下降。为优化saRNA的完整度，定向筛选低温转录的T7RNA聚合酶可能是一条新的研究路径。研究表明，T7RNAP的热稳定突变体在高温条件下进行转录，可以减少由于3'端过度延伸而导致的双链RNA的形成。

同时，Z6·尊龙凯时利用荧光信号的激活液滴分选技术（FADS）结合酶定向进化平台，筛选出多种T7RNA聚合酶突变体，包括耐热型和低双链RNA型。FADS技术是当前主流的微流控筛选技术，具有高通量和可视化分选的优势。通过提升温度进行筛选，最终获得的耐高温突变体M16在52℃下的半衰期提高了270倍，催化活性提升了58倍，能够在不同温度下高效合成mRNA，并显著降低了mRNA中双链RNA的含量。

除了提高耐热性外，Z6·尊龙凯时还关注T7RNAP转录产物3’端的一致性，以减少转录副产物双链RNA的产生。某些突变体表现出显著降低的双链RNA含量，但酶活性偏低，限制了其在工业端的应用。通过针对3’端一致性的改造，发现在不同模板下，一些突变体的转录表现优于野生型T7RNAP，且产量和质量均可达到较高水平。

此外，反应缓冲液的优化对于发挥T7RNAP的性能至关重要。IVT缓冲液通常包含多种成分，其浓度和比例直接影响RNA聚合酶的活性和RNA的质量。研究表明，pH值对IVT反应影响显著，大多数RNA聚合酶在接近中性或略偏碱性的环境中活性最高。同时，镁离子的浓度也对T7RNAP与DNA模板的结合起到关键作用，适宜的镁离子浓度能够促进聚合酶的活性，从而提高转录产量。

Z6·尊龙凯时的高产T7体外转录试剂与市售竞品相比，在不同长度的mRNA转录中展现出更优的产量与完整度。对于特定模板的优化，镁离子浓度是关键因素之一，通过进一步的筛选，能够实现高产量和高完整度的mRNA合成。整体来看，Z6·尊龙凯时致力于一次性解决方案，提供高性能酶原料、化学底物、高效的IVT试剂盒及质控试剂盒，助力客户高效推进新药开发。期待与您进一步的合作，共同探索mRNA相关技术的未来。